יוחאי ברק
מעבדה בביולוגיה (102) – פעילות דהידרוגנאז

חלק א' – חקירה מקדימה:
רקע ביולוגי: אחד השלבים במעגל קרבס הוא חימצון חומצה סוקצינית לחומצה פומרית ע"י האנזים דהידרוגנאז. בתהליך זה משתחררים מימנים. במערכת מעבדתית של תאים מרוסקים, ניתן לעקוב אחר ריאקציה זו באמצעות האינדיקטור מתילן כחול, המתחזר ע"י מימנים אלו ומאבד כך את צבעו הכחול.

1. א. הכן/י אמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות.
    ב. הכן/י מבחנה ובה 3 טיפות חומצה סוקצינית בריכוז M 0.5
                               1.6 מ"ל בופר (pH10)
                               1 טיפה של מתילן כחול כאינדיקטור
    ג. חתוך פיסת שריר (לב או קיבה של תרנגולת) בגודל 1 סמ"ק לערך ורסק אותה, בעזרת הסקלפל, לחתיכות קטנות ביותר, ככל הניתן.
    ד. הכנס את השריר המרוסק לתוך המבחנה ודחוף אותו לתחתית בעזרת מקל עץ או זכוכית.
   ה. מזוג לאורך הדופן של המבחנה מעט שמן פרפין כך שתווצר שכבת שמן בעובי של  כ- 0.5 מ"מ, מעל לנוזל שבמבחנה.
   ו. הכנס את המבחנה לאמבט המים וצפה במתרחש לאורך כ- 20 דק'.
                אין לטלטל את המבחנה.

2. תאר/י את תצפיותיך בתוצאות המחקר המקדים.
3. ניסוי זה חסר מרכיבים חשובים – ציין/י מהם והסבר/י תשובתך.
4. מדוע הוספנו שמן פרפין למערכת הניסוי.
5. מדוע לדעתך הקפדנו להשתמש בריקמת שריר ולא בריקמה אחרת?
6. הסבר/י מדוע חשוב היה לרסק את ריקמת השריר, בתחילת הניסוי.
7. מקובל על המדענים, לצרכי חישוב, כי ניפחה של טיפה 0.1 מ"ל.
    חשב/י את ריכוז החומצה הסוקצינית שבמבחנה לאחר הוספת כל החומרים ולפני הוספת השריר המרוסק.  פרט את דרך החישוב.  קבל/י את אישור המורה לחישובך לפני שתמשיך בעבודתך.
8. הניסוי בוצע בסביבת בופר pH10. מה ניתן ללמוד מעובדה זו על תכונות האנזים דהידרוגנאז?

חלק ב':  המחקר
רקע ביולוגי: לחומצה מלונית מבנה כימי הדומה מאד למבנה החומצה הסוקצינית. עקב המבנה הדומה, האתר הפעיל באנזים דהידרוגנאז יכול להיקשר גם לחומצה מלונית ואולם קישור זה אינו משחרר מימנים לסביבה. יודגש כי באופן טבעי, החומצה המלונית אינה נמצאת בתאי השריר.
9. הכן/י את מערך המחקר הבא:
א.	סמן/י 5 מבחנות במספרים 1-5. 
ב.	חדש/י את אמבט המים לטמפרטורה של 37 מעלות.
ג.	הכן את סידרת המבחנות בהתאם לנתונים שבטבלה שלהלן:
מספר מבחנה	נפח בופר
[מ"ל]	נפח ח. סוקצינית 
[טיפות]	נפח ח. מלונית
[טיפות]	נפח כחול מתילן
[טיפות]	ריכוז ח. סוקצינית
[M]	ריכוז ח. מלונית
[M]	יחס ריכוזים בין ח. מלונית וח. סוקצינית	זמן היעלמות צבע
[דק']	
1	1.8	3	  ---	1					
2	1.7	3	1	1					
3	1.7	3	2	1					
4	1.6	3	3	1					
5	1.6	3	4	1					
** מקור החומצה הסוקצינית הוא בריכוז M  0.5
** מקור החומצה המלונית הוא בריכוז M 1.0 
** נפח 1 טיפה הוא 0.1 מ"ל
*** יש לשים לב כי במבחנות השונות אין נפח סופי אחיד וזאת עקב הצרכים הכימיים של המחקר – יש לשים לב לכך בעת החישוב המתמטי.

ד.	חתוך 5 פיסות שריר בגודל 1 סמ"ק לערך רסק, כל אחת לחוד, בעזרת הסקלפל, לחתיכות קטנות, ככל הניתן. 
   ה. הכנס לכל מבחנה חתיכת שריר מרוסק ודחוף אותה לתחתית בעזרת מקל עץ או זכוכית.
   ו. מזוג לאורך הדופן של כל מבחנה מעט שמן פרפין כך שתווצר שכבת שמן בעובי של כ- 0.5 מ"מ מעל לנוזל שבמבחנה.
   ז. הכנס את כל המבחנות לאמבט המים וצפה במתרחש לאורך כ- 30 דק'.
      יש להקפיד על שמירת טמפרטורה קבועה לאורך כל הניסוי.
           אין לטלטל את המבחנות.
10. בעודך ממתין/ה לתוצאות תוכל/י להשלים את החישובים הנדרשים בטבלה.
11. בעת סיכום ממצאיך יהיה עליך להציג את התוצאות בתצוגה גרפית. באיזו דרך תבחר/י? בעקום או בעמודות? נמק/י בחירתך.
12. במערך המחקר שבצעת יש בעייתיות מסויימת הפוגעת במהימנות שלו. מהי? 
      [נבקשך להתעלם מבעייתיות זו כאשר תנתח/י את תוצאות הניסוי]
13. כיצד נקראת התופעה בה עסקת במחקר זה. קבע בהתאם כותרת לטבלה.
14. מדוע צוין ברקע הביולוגי כי הח. המלונית אינה נמצאת באופן טבעי בתאי השריר?
15. תכנן ניסוי שיהווה הוכחה נוספת לכך כי חימצון החומצה הסוקצינית הוא אכן תהליך אנזימתי.